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    微生物限度检查若干问题剖析

    微生物限度检查若干问题

    微生物限度检查若干问题

    微生物限度检查是对非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法,是药品微生物学检验的重要内容之一。中国药典2000年版二部附录ⅪJ“微生物限度检查法”、《中国药品检验标准操作规范》(2000年版)及参考书《药品微生物学检验手册》均做了详尽的阐述。下面对几个比较重要的问题,谈一点工作学习体会,仅供参考。

    一、实验室要求

    开展微生物限度检查工作,首先要按照《药品检验所实验室质量管理规范》及《药品生产质量管理规范》的要求,建立一个布局合理,使用方便,操作安全的实验室,并且配有完善的实验设施和管理制度。微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物检定实验室以及接种室(接种对照菌及菌种传代)均应严格分开。

    (一)无菌室:

    1结构与要求:

    最好设在二楼以上(防潮、防霉、采光好),面积不超过10平方米,高度不超过24米,由2个缓冲间和操作间组成。缓冲间与操作间之间应有样品传递窗,出入操作间和缓冲间的门不应直对。无菌室内应六面光滑平整,能耐受清洗消毒,墙壁与地面、墙壁与天花板连接处应呈凹弧形,无缝隙、无死角。

    无菌室内光照应不低于300勒克斯,缓冲间和操作间均应装有紫外线

    杀菌灯2-25w/m3作空气消毒用。紫外线波长200-300nm者''具有杀菌作用,其中以265-266nm最强,这与DNA的吸收光谱范围一致。其杀菌机理可能是在DNA中引起胸腺嘧啶双聚体形成,从而干扰DNA复制,导致细菌变异或死亡。紫外线杀菌灯1m以内距离杀菌效果最佳''每次开灯照射时间为20min。其缺点:穿透力弱,一张纸可以挡住,不能穿透固体物,对人的皮肤眼睛有损伤,所以紫外线灯开关应装在无菌室外便于开关。

    2温度、湿度:温度应控制在18-26℃''相对湿度40-60''操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正比''不低于49Pa。

    3操作间:应安装空气除菌过滤层流装置,操作间不应安装下水道,洁净度不低于1万级,净化工作台局部应为100级。操作间应准备电子称(感量01g''最大称量300g''乙醇灯''火柴''2碘酊及75乙醇棉球,大、小橡皮乳头,记号笔,灭菌的剪刀,镊子、注射器等。

    4缓冲间:应有洗手盒、消毒液、无菌衣、帽、口罩,拖鞋等,不应放置培养箱和其他杂物。

    (二)洁净级别及检查方法:

    通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法。

    98年国家药监局颁布药品生产质量管理规范''把药品生产洁净区空气

    洁净度划分为四个级别:

    空气洁净度级别表

    ────────────────────────────

    尘埃数/立方米活微生物数个

    洁净级别─────────────────────

    ≥05μm≥5μm浮游菌/立方米沉降菌/皿

    ────────────────────────────

    100级≤3500≤0≤5≤1

    1万级≤35万≤2000≤100≤3

    10万级≤350万≤2万≤500≤10

    ────────────────────────────

    尘埃数:用尘埃粒子计数器测定,取样高度离地面1米,间距05-2米''每个测试点连续采样3-5次,仪器显示结果。

    沉降菌数测定:无菌室及净化工作台面消毒擦拭后,先启动层流净化装置30min,将营养琼脂平板3个及改良马丁琼脂平板3个直径9cm,置净化台左、中、右各1个''开盖,暴露30min后将盖盖上。分别在30-35℃培养48h及25-28℃培养72h''细菌和真菌总数不超过1个为100级。

    无菌室应在每次操作前后均用01苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭台面及紫外线照射不到可能污染的死角;用消毒液湿拖地面。实验室一旦被污染''洁净度达不到要求''可以清洗或更换净化工作台过滤器''甲醛或丙二醇''乳酸熏蒸消毒''方法:支架上放一个烧杯(内装少许甲醛,8ml/平方米''下面放一个装有少许乙醇的乙醇灯点燃后,关闭门窗,乙醇用尽后灯自灭,甲醛蒸气充满无菌室,密闭24h。

    缺点:甲醛蒸气易锈蚀仪器,对人有刺激,可用氨水中和,减少对人眼的刺激。

    二、无菌操作

    指在无菌的环境条件下,使用无菌的器材,防止微生物污染的操作技

    术。从事微生物检验的工作人员必须经过无菌技术及基础微生物学专业知识培训,才具备上岗操作的资格。所用的物品需清洗、干燥、包扎,无菌。

    干烤箱160℃2h''适用于培养皿9cm、试管、吸管、锥形管、剪刀、镊子物品的灭菌;培养基及09氯化钠溶液用高压锅湿热灭菌''含糖培养基一般用113℃30min''以防温度过高成分被破坏;一般培养基115℃30min;09氯化钠溶液可用121℃20min即可。

    操作者在缓冲间换拖鞋,用肥皂洗手后,穿戴无菌工作服、帽、口罩,操作前用01苯扎溴铵泡手''75乙醇棉球擦拭双手后''在乙醇灯火焰区操作。操作中切勿用嘴直接吸吹吸管防止致病菌感染操作人员及口中的杂菌污染供试品。

    三、药品微生物检验的特点

    (一)活体易变性:被污染的供试品中活的微生物具有繁殖能力,如细菌以二分裂法无性繁殖,20分钟繁殖一代,一个细菌10个小时后可变成10亿个细菌。如糖浆剂细菌数标准为100个/ml,出厂时检验结果合格,由于贮存不当,放置一段时间成为不合格药品,由于营养成分耗尽细菌自身代谢产物所致的毒性或pH值改变''细菌逐渐死亡,又成为合格药品。

    (二)分布不匀:由于生产环节多,从原料、中介体到成品,经过生产多个流程,与不同操作人员接触,特别是生产后期被污染,通常是局部的,药品微生物的污染存在着不均性。

    要求:随机取样,二个包装以上,操作前,供试品摇匀后取样。

    (三)受损状态:药品中污染的微生物,受到加工、加热过程的机械损伤,药品本身的抑菌杀菌作用,处于受损抑制状态,检验时必须创造适

    宜的生长环境(培养基的营养、pH值等)使细菌复苏,从而提高检出率。如口服制剂,必须检查控制菌大肠杆菌,取1:10的供试液10ml加入胆盐乳糖增菌液中,胆盐乳糖增菌液是分离大肠杆菌的选择培养基,蛋白胨乳糖等成分提供氮源碳源外,胆盐是抑菌剂,对革兰阳性菌有良好的抑菌作用,从而使目的菌更好地生长。

    (四)生态环境多样复杂性:药品的种类、剂型繁多,使污染的微生物生态环境多样而复杂。故对不同的供试品分别采用不同的方法,正确地制备供试液,使药品中污染的微生物得以真实反映,是保证检验结果正确可靠的重要前提条件。

    四、供试液的制备:

    将供试品制成供试液(一般为1:10),有利于供试品中污染的微生物分散,与培养基充分接触,提高阳性检出率。

    常用稀释剂为09无菌氯化钠溶液,滴眼剂、王浆、蜂蜜制剂可直接用供试品(原液),作为供试液。

    在作10倍递增稀释时,吸管插入第1级稀释液内不低于25cm,上下反复吸吹约10次。吸液时,应先吸至高于吸管上部刻度少许,然后提起吸管,贴于试管内壁调整液量至刻度,再沿第2级稀释管的内壁在液面上1cm 处缓慢吹出全部液体。每个稀释级需更换吸管。

    (一)一般供试品供试液的制备:

    1液体制剂:糖浆剂等取样10ml至含有玻璃珠的锥形瓶内,加入09

    无菌氯化钠溶液90ml1:10的供试液。油剂:取样10ml''加聚山梨酯-805ml''再加稀释剂至100ml。不提倡将稀释剂定量分装后再灭菌,因高压灭菌易使

    液体蒸发损失。

    2固体制剂:

    片剂:称样10g至研钵量取稀释剂100ml,先加10ml浸没样品,研磨,将上层液倒入锥形瓶,再加少许稀释剂研磨,同上操作直至样品全部研细制成1:10的供试液。

    丸剂及锭剂:中药蜜丸取4丸以上剪碎后称样10g''放置匀浆仪专用的不锈钢匀浆杯内,加入稀释剂100ml,3000转/分''2min制成1:10的供试液。

    胶囊:硬、软胶囊,称样10g,加入稀释剂100ml''放45℃水浴10分钟后振摇''使溶解。

    肠溶片(胶囊)、稀释剂用无菌磷酸盐缓冲液pH68100ml。

    茶剂:称样10g加稀释剂100ml浸泡30min,用无菌纱布过滤取滤液(1:10的供试液。

    袋泡茶取2袋称量''加稀释剂配成1:10浸泡30min。

    胶剂:如阿胶,先放4℃冰箱1h''取出后立即称样10g,放入匀浆仪内捣碎或用无菌的不锈钢捣罐捣碎,放45℃水浴促溶。

    气雾剂:不含抛射剂的可拧开取样10ml,加稀释剂90ml1:10含抛射剂,需先放4℃冰箱1h减压,然后用无菌钢锥钻孔(勿拨出钢锥),转动钢锥使抛射剂徐徐抛出,再用无菌注射器抽出全部药液,然后按标示量用稀释剂补足为原液,以下操作同液体制剂。

    乳膏剂:称样10g,加聚山梨酯-805ml促溶''加稀释剂至100ml。

    非水溶性供试品:司盘单硬脂酸甘油酯法:眼膏、软膏剂,以凡士林为基质,不溶于水需加乳化剂使供试品乳化。用减量法称样5g,加入含

    已灭菌溶化并保温45℃左右的司盘-805g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯-8010g混合物的烧杯中,在45℃水浴中振摇使供试品中凡士林基质乳化''

    慢慢加入45℃左右的09无菌氯化钠溶液85ml''边加边振摇制成1:20供试液。

    (二)抑菌性供试品供试液的制备

    抑菌及抗菌性药品,如抗生素、沙星类,既然有抑菌杀菌作用,为什么还要做微生物限度检查,其原因是:

    ①被污染的微生物在抗菌药品中因生存环境不利,呈休眠受损状态,但未死亡,一旦用于人体,当条件改变或适宜时,便复苏仍可生长繁殖,对人体造成危害。有的耐药性致病菌株可成为对该抗菌药的依赖株。

    ②抗细菌的药品,不能抗真菌,所以可能被真菌污染;抗真菌的药品不能抗细菌,所以可能被细菌污染,故2000年版药典要求口服抗生素抗细菌的药品检查真菌,抗真菌的药品检查细菌。

    细菌数及真菌数的测定,供试品未经特殊处理,因三级稀释,基本上可起到稀释后消除抑菌成分的作用。

    1稀释法:取1:10的供试液10ml加入增菌液在200ml以上

    2沉降法:制成1:10的供试液摇匀后静置10min,使药品中污染的微生物混悬于供试液中,难溶于水的抑菌成分自然沉降在容器底层,吸取上层液10ml至增菌液。

    1、2法适合于抑菌性弱的药品。

    3薄膜过滤法:由于细菌的直径约1μm''利用045μm微孔滤膜阻截细菌,滤除抑菌成分,冲洗膜上残留抑菌成分,达到消除抑菌成分之目的。如氯

    霉素滴眼液,取1:10的供试液40ml,通过直径为50mm装有045μm孔径微孔滤膜的无菌滤器,过滤后用09无菌氯化钠溶液冲洗,冲洗量约1000ml,无菌手续取出滤膜放至无菌平皿内,剪成四等份,各取一片分别放置营养内汤增菌液二瓶(其中一瓶加入金黄色葡萄球菌50-100个及胆盐乳糖增菌液二瓶其中一瓶加入铜绿假单胞菌50-100个。同时做阴性对照(加稀释剂10ml)。

    凡士林基质的眼膏、软膏减量法称样10g,加十四烷酸异丙酯20ml''摇匀''使凡士林基质溶解后徐徐加入09无菌氯化钠溶液80ml1:10边加边摇''静置''待分层''取水层20ml加稀释剂至100ml,过滤,冲洗(量1500ml''剪膜操作同上。

    4离心沉淀法:利用供试品药物颗粒及细菌不同物质质量的差异,在离心力的作用下达到分离的目的。

    一次离心法:取1:10的供试液20ml分别放至二支尖底离心管内各

    10ml,其中一支管内加入阳性对照菌50-100个''3000转/分''5分钟,弃去上层可溶性抑菌成分。

    二次离心法:操作同上,第一次离心500转/分,3分钟''弃去沉淀药渣及不溶性抑菌成分;第二次离心3000转/分''5分钟''弃去上层可溶性属抑菌成分''取沉淀物约05ml加至增菌液中。

    5中和法:如磺胺类药品,1:10的供试液摇匀后,先用沉降法,弃去沉淀(因磺胺药几乎不溶于水,沉于管底,污染菌在稀释剂中),取上层液10ml加入含1对氨基苯甲酸05ml的增菌培养基中,即可中和磺胺类药的抑菌作用。

    对于复方磺胺制剂,需上法与薄膜过滤法联合应用方能奏效。

    五、结果判断:特殊情况的处理方法

    1延长培养时间,菌落极小,不易辨认,可延长培养至4-7天。乙醇提取的制剂,可延长培养时间再计数。

    2排除药物颗粒:药物颗粒及培养基沉淀物、气泡、乳化剂等会影响结果判断,处理方法:

    ①多倾注平皿,放冰箱(勿冷冻),对照看结果。

    ②配制无菌1TTC氯化三苯四氮唑溶液,营养琼脂400ml加1TTC04ml 混匀''浇平皿''细菌颜色呈红色''易辨认。

    3不能作为计数依据:

    ①二个平皿菌落15个''二个平皿菌数相差1倍以上

    ②二个平皿菌落≤15个''二个平皿之间菌落不在

    0-4''1-7''2-9''3-10''4-12''5-14''6-15。

    ③片状菌落无法计算。

    4防止片状菌落形成:

    ①营养琼脂中加入1TTC见上

    ②换新近干烤灭菌陶瓦盖''倒置培养

    ③待琼脂凝固后''平皿倒置斜放净化台上''吹1h

    5特殊情况报数:

    ─────────────────────────────

    营养琼脂平皿玫瑰红钠琼脂平皿计数

    ─────────────────────────────

    有细菌、真菌生长不生长以前者计数

    不生长有细菌真菌生长以后者计数

    有细菌、真菌生长有细菌真菌生长以长菌多的平皿计数

    不能两种平皿同时计

    一种菌

    ─────────────────────────────

    6培养基稀释法

    当高稀释级菌数比低稀释级菌数多,有抑菌现象:菌数不规则时可采用此法。

    取1:10供试液三份''每份1ml''分别注入5个平皿每个平皿02ml,倾注营养琼脂,混匀,凝固后,倒置培养,计数,5个平皿点计的菌落数之和即为每1ml菌落数。三份共15个平皿,每个平皿加入02ml供试液。

    ───────────────────

    1:10菌落计数

    12345X

    ───────────────────

    1ml151514791578

    1ml111511121160

    1ml141612181171

    ───────────────────

    计算:209/3696个/ml×稀释倍数696报数700个/gml

    六菌种的保藏:

    菌种保藏是微生物学基础工作中的一项重要内容,用人工方法低温干燥,缺氧等抑制微生物的代谢,以达到保种。保持菌种原有的各种生物学特性,不变异,不污染的目的。

    国内药品微生物检验所用的菌种是CMCCB''即医学微生物菌种保藏管理中心BBacteria代表细菌''FFungi代表真菌。

    方法:①琼脂斜面:将营养琼脂培养基内按05加入琼脂粉配制,用于细菌接种传代,硅胶橡皮塞塞紧,放4℃冰箱保存,2-3个月传一次。

    ②半固体琼脂:营养肉汤培养基内按05加入琼脂粉配制''穿刺接种''置冰箱保存''6-12个月传一次。

    ③真菌琼脂斜面

    蛋白胨5g

    酵血浸出粉2g

    葡萄糖20g

    磷酸氢二钾1g

    硫酸镁05g

    琼脂粉10g

    水1000ml

    如白色念珠菌10231,划线接种后,置20~25℃培养24h。3-6个月传一次。

    ④沙氏琼脂斜面:用于真菌传代

    蛋白胨10g

    葡萄糖10g

    琼脂粉10g

    水1000ml

    ⑤40甘油水接种细菌培养后,放冰箱保存,12月传1次。

    ⑥需气菌、厌气菌培养基:生孢梭菌CMCCB64941菌液取01ml至需气菌、厌气菌培养基15ml''在30-35℃培养18-24h。

    菌种应由专人保管''菌种的购入、传代、使用销毁等均应有记录。定期检查、分离、纯化以防菌种变异及衰退。

    七、细菌计数方法:

    ①10倍递增稀释:用接种环取斜面菌苔少许,接种至营养肉汤2ml''培养后为菌原液''取10支试管,每管装稀释剂9ml''取菌原液1ml至第一管与9ml稀释剂混匀为1:10''依次稀释。如取10-601ml在营养琼脂平皿上划线培养计数。

    ②二管法:取二支试管,管内装稀释剂5ml''用接种环直径3mm,取一环菌原液至第一管''摇匀,烧接种环,从第一管再取一环至第二管,混匀,从第二管取01ml为50-100个菌。(可同时取01ml在营养琼脂平皿上划线培养计数)。

    ③64941计数方法。

    取10支试管,每管装需气菌、厌气菌培养基9ml,取第一天24h培养的菌原液1ml至第一管与9ml需厌气培养基混匀为1:10,依次稀释。

    结果观察:

    ──────────────────────────────

    稀释倍数10-110-210-310-410-510-610-710-810-910-10

    ──────────────────────────────

    菌落计数浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊不可计92清亮清亮

    ──────────────────────────────

    注:10-1至10-5管浑浊,10-6管可见灯笼状菌落悬挂,但无法计数,10-7管中可见9个菌落悬挂,10-9~10-10管无菌落生长。

    推算:10-7管有9个菌/9ml''为1个/ml''10-4管为1000个/ml,取10-4管01ml有100个菌。

    MUG-Indole大肠埃希氏杆菌检查法

    一、原理

    大肠埃希氏杆菌具有β葡萄糖醛酸苷酶,在弱碱性条件下,可使培养基中底物分解,其分解产物在365nm紫外光下呈现荧光。

    分解

    大肠埃希氏杆菌(β葡萄糖醛酸苷酶)4-甲基伞形酮葡糖苷酸

    PH74

    (MUG)培养基葡萄糖醛酸苷4甲基伞形酮(365nm紫外光下呈现荧光。)二方法与步骤

    供试品供试液BL(待检样品)37℃

    (1:10)BL(阳性对照)各取02ml接种

    稀释剂BL(阴性对照)18-24h至MUG培养基

    37℃无荧光:MUG-滴加靛基质试液(I)

    365nm有荧光:MUG+液面为试剂本色I-

    5-24h紫外光下液面为试剂本色I

    三结果判断

    MUG-I检查法结果判断

    MUGIEMBIMViCG染色报告

    阴性对照管--

    阳性对照管++

    ++检出大肠埃希氏杆菌

    --未检出大肠埃希氏杆菌

    +-无菌落生长

    (-)(+)未检出大肠埃希氏杆菌

    -+-+--G_菌

    (+)(-)有菌落生长++--G_菌检出大肠埃希氏杆菌